腺相关病毒载体AAV 丨基因载体丨技术服务 - 亚搏app足球-中国有限分公司

腺相关病毒载体AAV

颇有前途且应用广泛的病毒载体

腺相关病毒载体（Adeno-associated virus， AAV）由直径约20-26nm的正二十面体蛋白质衣壳和约4.7kb的单链DNA基因组组成，AAV无包膜，不能独立自主复制，主要以游离于染色体的附加形式存在。研究中采用的重组腺相关病毒载体（recombination adeno-associated virus，rAAV）是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性很低、应用性高、宿主细胞范围广（对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力）、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为很有前途的基因研究和基因治疗载体之一。

腺相关病毒载体类型

不同血清型rAAV的衣壳蛋白识别的细胞表面的受体不同，具有一定的器官靶向特异性。利用这个特点，对特定血清型rAAV衣壳蛋白Cap基因进行定向突变改造，可以筛选到具有高转导效率和不同感染性的rAAV载体。Scilia提供不同血清型的rAAV，具体如表格所示：

血清型	组织亲和性
rAAV2/1	神经系统（高滴度顺向跨突触），肌肉，骨骼肌，心肌，平滑肌
rAAV2/2	视网膜，神经系统，肌肉，肝脏，血管平滑肌
rAAV2/3	肌肉，肝脏，肺，眼
rAAV2/4	神经系统，肌肉，眼，脑
rAAV2/5	神经系统，肺，视网膜，肝脏，滑膜关节
rAAV2/6	神经系统，肺，肌肉，心脏
rAAV2/7	肌肉，肝脏
rAAV2/8	神经系统，肝脏，肌肉，脂肪组织，胰腺，视网膜
rAAV2/9	神经系统，心肌，肺，视网膜，皮肤
rAAV2-retro	神经系统（逆向非跨突触）
AAV-PHP.eB	跨血脑屏障（静脉注射）
AAV-PHP.S	全外周神经（尾静脉注射）
AAV-PAN	胰腺（腹腔注射）
AAV-LUNG	肺（尾静脉注射）
AAV-DJ	视网膜，肺，肾脏，体外感染细胞
AAV-7m8	视网膜
AAV-ShH10Y	视网膜Muller细胞
AAV-Rh10	肝脏，血液，心脏，体外感染细胞
AAV-Anc80L65	内耳、视网膜、骨骼肌、肝脏
AAV-SCH9	SVZ区神经干细胞

根据客户需求选择相应靶向性的rAAV血清型。如果仅需要在某个部位表达，可以选择特异性的启动子。

常用启动子列表
CAG/CBG/CMV/EF1a	常用广谱启动子	GFAP	星形胶质细胞（长启动子）
hSyn	成熟神经元	shortGFAP	星形胶质细胞（短启动子）
CaMKllα	投射神经元	GfaABC1D	星形胶质细胞
GAD67	GABA能中间神经元	Iba1/CX3CR1	小胶质细胞
mDLx	GABA能中间神经元	MBP	少突胶质细胞
fPV	PV+中间神经元	NG2/NGL2	少突胶质细胞前体细胞
fNPY	NPY+中间神经元	TH	儿茶酚胺能神经元（DA、 NE、E）
fSST	SST+中间神经元	PRSx8	去甲肾上腺素能神经元
DAT	多巴胺能神经元	ChAT	胆碱能神经元
L7pcp²	小脑蒲肯野细胞	D1/D2	多巴胺D1/D2受体神经元
FEV	五羟色胺能神经元	HCRT	下丘脑食欲素神经元
cTNT	心肌细胞	TBG	肝脏

腺相关病毒载体AAV包装生产流程

步骤	描述	时间
三质粒转染	使用的helper-free腺相关病毒包装系统包括1个负责编码目的基因以及两个末端反向重复序列（ITR，对于病毒的复制和包装具有决定性作用）转移质粒（Transfer plasmid）、1个Rep （参与病毒的复制）和Cap（编码病毒衣壳蛋白）表达质粒（Rep-Cap plasmid）和1个编码介导腺相关病毒复制的腺病毒基因（E2、E2A和VA）的辅助质粒（Helper plasmid）其包装过程是将转移质粒、 Rep-Cap 质粒和辅助质粒共转染HEK293细胞，AAV 病毒开始复制和包装。	第1天
收集细胞上清	在细胞里，转导质粒表达包含目的基因（Gene of Interest，GOI）的AAV基因组， Rep-Cap质粒表达特定血清型的AAV衣壳蛋白，辅助质粒表达辅助AAV基因组表达翻译的组分。三者共同作用，在细胞中生成完整的AAV病毒颗粒。细胞短暂孵育后，根据血清型的不同，收集上清或者细胞裂解液获取病毒颗粒。	第3天
病毒载体共转	所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化，对于超速离心纯化腺相关病毒，需进一步纯化和浓缩。	第5天
质控检测	采用qPCR方法进行病毒滴度测定（Titer determination），用SDS-PAGE方法进行病毒纯度检测（Virus puritytest）；若转移载体上有荧光蛋白标签，还可进行细胞转染以检测荧光表达（Transduction test）和内毒素含量（Endotoxin test）等。	第7天及以后

三种工具病毒ADV & LV & AAV的特点比较

病毒表达系统	腺病毒ADV	腺相关病毒载体AAV	慢病毒LV
病毒基因组	dsDNA	ssDNA	ssRNA
基因组大小	36kb左右	4.8kb左右	9kb左右
病毒颗粒直径	90-100nm	20-30nm	80-100nm
包装/克隆容量	≤7.5kb	≤3kb	≤4kb
病毒滴度	10¹⁰-10¹¹pfu/ml	10¹²-10¹⁴vg/ml	10⁸-10⁹TU/ml
感染的细胞类型	分裂和非分裂细胞	分裂不旺盛细胞	分裂和非分裂细胞
表达丰度	高水平瞬时表达	高水平表达	中到高水平表达
表达时效性	短暂（1-2天开始表达，持续≤2-4周）	潜在的长久（7-14天开始表达，持续3-6个月）	长久（2-4天开始表达，持续≥6个月）
外源基因整合至宿主基因组	非整合	非整合	整合
免疫原性	较高	很低	低
应用	细胞/动物较大基因过表达	动物实验常用载体；基因治疗药物载体	细胞实验常用载体；CAR-T治疗的递送载体
安全性	BSL-2	BSL-1	BSL-2

rAAV病毒包装服务内容

定制服务内容	交付周期	交付内容	交付规格
rAAV 小量定制（总量1×10¹²VG，滴度≥2×10¹²VG/mL)	3周左右	rAAV病毒和质检报告	50μl/管
rAAV 中量定制（总量5×10¹²VG，滴度5×10¹²VG/mL)	3周左右	rAAV病毒和质检报告	50μl/管
rAAV 大量定制（总量1×10¹³VG，滴度1×10¹³VG/mL)	3周左右	rAAV病毒和质检报告	50μl/管

*表中时间为平均交付时间，最终以项目评估时间为准。赠送50μl对照病毒（一般为空载或带荧光标签病毒，其他特殊对照需要定制）

运输与存储

rAAV病毒存储在PBS缓冲液中，并采用干冰运输。收到rAAV病毒后，立即放置于-80℃，可保存约一年。若放置于-20℃，则可保存2-3周。融解后的rAAV病毒可在4℃保存1-2周。虽然rAAV病毒比其他多数病毒稳定（如慢病毒），但是也请避免反复冻融，因为这会导致rAAV病毒滴度显著下降。

数据展示图

293 cell

AAV 感染荧光图

常见问题解答

1、什么时候选择rAAV?

rAAV对分裂细胞和非分裂细胞均有感染能力，体内和体外实验皆用。当您不确定如何选择病毒时，您可以致电亚搏app足球的技术服务，会为您提供专业的解答。
2、rAAV生物安全要求？

重组腺相关病毒和慢病毒一样都是复制缺陷的假病毒载体，安全无害。使用条件符合在常规BSL-1实验室橾作。
3、AAV是否是复制缺陷性的？

野生型AAV不能独立存在，需在辅助病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒存在条件下，才能在感染的宿主细胞中复制合成、装配蛋白，产生新的病毒颗粒。重组AAV载体（rAAV）的制备即AAV的rep及cap基因由外源基因表达框替代，而只保留了两端的ITR序列，在生产rAAV时，需要提供Rep和Cap蛋白的反式功能以及其他辅助病毒的辅助功能，带有外源基因的重组AAV基因组才会被营救、复制并包装成rAAV病毒。
4、rAAV包装能力？

AAV包装能力可以达到4.9kb。两端ITR200-300bp，外源基因插在两个ITR之间，随着插入外源基因的变大，AAV的包装能力降低。
5、AAV感染小鼠后多久可以观察结果？

一般悄况下，三周后可在细胞体检测到信号，六周后可在末梢检测到信号。
6、AAV光控病毒刺激的频率和强度是多少？

刺激频率和强度和病毒没有关系，是研究的问题决定的，一般刺激胞体强度5-10mW，轴突10-15mW，频率和剌激的细胞特性有关，5-60hz不等。
7、rAAV储存条件，冻融一次会有多大的损失？

－80°C分装储存，冻融一次损失10%，应避免反复冻融。保存6-12个月以上的样品，进行试验前，重新测一次滴度。病毒产品解冻后最好保持在冰浴中，并尽快使用。如果解冻后的病毒一时用不完，滴度足够高时，4°C可保持1-2周。但应尽快使用，一般4°C放置一周。滴度会有4-5倍的下降。
8、rAAV可以稀释吗？方法如何？

可适当稀释，在实验过程中稀释病毒的等渗溶液没有其他特殊要求，常规的动物实验用PBS，生理盐水等即可。稀释后的样品尽最一次性用完。
9、定制rAAV周期一般是多久？

1-4周左右。
10、rAAV外源基因表达时长是？

半年（或者更久）。

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